Сова приложила ухо к груди Буратино.— Пациент скорее мертв, чем жив, — прошептала она и отвернула голову назад на сто восемьдесят градусов.Жаба долго мяла влажной лапой Буратино. Раздумывая, глядела выпученными глазами сразу в разные стороны. Прошлепала большим ртом:— Пациент скорее жив, чем мертв...Народный лекарь Богомол сухими, как травинки, руками начал дотрагиваться до Буратино.— Одно из двух,— прошелестел он, — или пациент жив, или он умер. Если он жив — он останется жив или он не останется жив. Если он мертв — его можно оживить или нельзя оживить.— Шшшарлатанство, — сказала Сова, взмахнула мягкими крыльями и улетела на темный чердак.У Жабы от злости вздулись все бородавки.— Какакокое отвррратительное невежество! — квакнула она и, шлепая животом, запрыгала в сырой подвал.Лекарь Богомол на всякий случай притворился высохшим сучком и вывалился за окошко.А.Н.Толстой. Золотой ключик, или Приключения Буратино
Чудо невидимого мира
В 1702 году в Лондонское Королевское общество содействия развитию знаний о природе (The Royal Society of London for the Improvement of Natural Knowledge) поступило письмо от одного из зарубежных его членов, озаглавленное «О некоторых Animalcules (лат. микроскопических животных. — Е.П.), найденных в осадках сточных желобов крыш домов». В нем были представлены следующие наблюдения: «Я часто доставал этих описанных мною ранее Animalcules из воды... чтобы посмотреть, лопнут ли они после того, как вода вокруг них испарится и они окажутся на воздухе, как мне приходилось видеть в случае других Animalcules. Так вот теперь я обнаружил, что, когда почти вся вода испарилась и каждое существо уже не было покрыто водой, оно не двигалось как обычно, а сжималось, принимая овальную форму, но я не мог понять, испарилась ли влага из его тельца... Чтобы полнее удовлетворить свое любопытство в этом отношении, 3 сентября, около семи часов утра, я взял немного сухого осадка, который собрал из свинцового сточного желоба и который простоял у меня в комнате почти два дня, положил его помаленьку в две стеклянные пробирки, куда потом налил охлажденной кипяченой дождевой воды... Сразу после того, как налил воду, я все это перемешал, чтобы осадок скорее смешался с водой, так как из-за волосков в нем он казался слипшимся как твердое тело; и когда он осел на дно пробирок, я исследовал его и заметил несколько этих Animalcules, лежащих плотно прижавшимися друг к другу. Вскоре после этого они начали удлинять свои тельца, а через полчаса по меньшей мере сотня из них уже плавала... Эти эксперименты я повторял многократно с тем же успехом, в частности с сухим осадком, который пролежал у меня в комнате около пяти месяцев... А если эти Animalcules после пребывания в сухом состоянии столь длительное время способны в воде вновь расправляться и двигаться обычным образом, то можно заключить, что во многих местах, где летом вода застаивается и затем высыхает, может быть много видов Animalcules, которые исходно там не обитали, а были занесены туда (из других мест) на лапах и перьях водоплавающих птиц» (цит. по: D. Kеilin. «The Leeuwenhoek Lecture. The problem of anabiosis or latent life: history and current concept». «Proceedings of the Royal Society, Ser. B», 1959, 359, 149—191).
Так впервые было описано одно из чудес биологического мира — обратимый переход живых организмов в состояние, при котором они не проявляют признаков жизни. Автором этого открытия был голландский торговец мануфактурой и член Лондонского Королевского общества Антони ван Левенгук, а было ему тогда 70 лет. Свои наблюдения он производил с помощью миниатюрных увеличительных стекол (линз), секрет изготовления которых сохранил в тайне до конца своих дней. Линзы были встроены в специальную конструкцию, позволяющую довольно точно устанавливать объект, размещенный на игле, в фокус и добиваться более чем 200-кратного увеличения (рис. 1). Чтобы рассматривать объект, конструкцию подносили к глазам.Это устройство принято называть «микроскопом Левенгука», однако, строго говоря, оно не является микроскопом в современном понимании. В настоящее время принято считать микроскопами устройства, состоящие из двух систем линз — объектива и окуляра. Интересно, что такие микроскопы разработали еще в 1595 году: Роберт Гук — в Англии и Ян Сваммердам — в Нидерландах. Впрочем, это не умаляет достоинств Левенгука как исследователя и первооткрывателя. Благодаря своему «микроскопу» и еще в большей степени пытливому стремлению к новым знаниям, он первым открыл и описал многих микроскопических существ, от бактерий до мелких беспозвоночных животных.
Дебри семантики
Левенгук больше не исследовал обнаруженный им феномен и не дал ему какого-либо специального названия. Не уделили достаточного внимания его открытию и современники-натуралисты, как минимум по двум причинам. Во-первых, это было единичное наблюдение с использованием оригинального приспособления, не подтвержденное ничьими независимыми наблюдениями. Во-вторых, невидимый невооруженным глазом мир микроскопических существ воспринимался в те времена вообще как другой мир, не связанный с макромиром.
Лишь полвека спустя появились первые сообщения английских натуралистов Джона Нидхема и Генри Бейкера о похожих наблюдениях. А уже в конце XVIII века итальянский священник и натуралист (тогда эти профессии у многих успешно совмещались) Ладзаро Спалланцани не только подтвердил факты, описанные Левенгуком, но и охарактеризовал тех самых Animalcules. Ими оказались животные, известные в настоящее время как коловратки (типRotifera, или Rotatoria) и тихоходки (тип Tardigrada) (рис. 2, 3).
2. Некоторые представители коловраток (оптическая микроскопия). Длина тела этих животных 0,04—2,0 мм
3. Тихоходка Hypsibius dujardini под электронным микроскопом. Длина ее тела 0,1—1,5 мм
Спалланцани назвал рассматриваемый феномен «воскрешением убитых животных». В 1872 году немецкий физиолог Вильям Прейер предложил более «научный» термин — анабиоз, «возвращение к жизни», от греческого ана — «вверх» и биос — «жизнь». Общим же у Спалланцани и Прейера, а также ряда других ученых было представление о том, что высушенные микроскопические животные в буквальном смысле перестают быть живыми и при насыщении их тел водой вновь оживают.
Постепенно накапливались сведения о многочисленных случаях оживления не проявляющих признаков жизни представителей разных групп организмов не только в высушенном состоянии, но также при пониженных температурах и в не- которых других условиях. Наряду с феноменологическими наблюдениями разнообразных проявлений живого мира развивались и представления о том, что его отличает от мира неживого. Сформировалось понимание, что в основе жизни лежит метаболизм (обмен веществ) — совокупность биохимических реакций, организованных в пространстве и времени. При этом пространственно-временную упорядоченность метаболизма в значительной мере обеспечивает структурная организация клеток.
Наконец, в 1959 году английский энтомолог и паразитолог Дэвид Кейлин предложил характеризовать все организмы в соответствии с уровнем их метаболизма. По этому показателю он выделил три состояния: нормальный метаболизм, пониженный, или гипометаболизм, и отсутствие метаболизма — аметаболизм. Состоянию аметаболизма Кейлин присвоил специальный термин — криптобиоз, или скрытая жизнь. Он отметил, что именно его наблюдал Левенгук, а Прейер назвал анабиозом. Необходимость же в новом термине ученый объяснил тем, что, по его мнению, жизнь в этом состоянии не прекращается, а приостанавливается, делается скрытой. «В живом активном организме, — писал Кейлин, — состояние множества его компонентов — результат динамического равновесия реакций, участвующих в их постоянном разрушении и регенерации... Стабильность такого организма имеет динамическую природу. При криптобиозе организм не может поставлять энергию для сохранения своей сложной структуры, но которая тем не менее остается интактной... Стабильность такого организма имеет чисто статическую природу...»
Представления Кейлина поддержал советский биолог Александр Михайлович Голдовский, занимавшийся проблемой длительного хранения семян растений. Он также трактовал анабиоз как остановку метаболизма при сохранении жизненно важных структур, однако для обозначения состояния аметаболизма предпочел пользоваться термином Прейера «анабиоз», а состояние гипометаболизма предложил называть гипобиозом. А.М.Голдовский несколько расширил классификацию Кейлина, предложил, например, выделить искусственный, полученный в лабораторных условиях, и естественный — природный анабиоз.
В русскоязычной научной и даже художественной литературе сложилась традиция пользоваться термином «анабиоз» вслед за П.Ю.Шмидтом, Л.К.Лозиной-Лозинским, А.М.Голдовским и др. В англоязычной литературе чаще встречается термин «криптобиоз».
Немножко умереть... чтобы выжить
Границу между анабиозом и гипобиозом трудно выявить экспериментально, поскольку практически невозможно «измерить» метаболизм в целом, особенно едва уловимый. В то же время, по-видимому, можно говорить об «истинном» анабиозе, когда метаболизм становится теоретически невозможным, — например, при значительной дегидратации организмов (до остаточной влажности 10% и меньше) или глубоком замораживании до температур ниже -80°С. Расчеты показали, что при содержании воды в клетках около 10% и меньше ее недостаточно даже для того, чтобы покрыть все белки хотя бы молекулярным монослоем. А при температурах ниже -80°С практически вся вода в биологических образцах гарантированно превращается в лед и поступательное движение молекул прекращается. Не исключено, что какие-либо химические процессы в обоих случаях все же происходят, однако метаболизм как скоординированное в пространстве и времени течение биохимических процессов прекращается. На основании этих соображений выделяют две формы анабиоза: ксероанабиоз, который в англоязычной литературе называют ангидробиозом, и низкотемпературный, или криоанабиоз.
Со времен Левенгука описано множество организмов, которых, как писал Спалланцани, «природа одарила привилегией наслаждаться истинным воскрешением после смерти». Многие организмы в природных условиях погружаются в так называемый вынужденный ксероанабиоз. «Привилегию» переживать дегидратацию имеют многие, если не все виды микроорганизмов, низшие растения (мхи, лишайники) и вегетативные формы некоторых высших растений, таких, например, как рамонда сербская Ramonda serbica и селагинелла чешуелистная Selaginella lepidophylla (рис. 4).
4. Селагинелла чешуелистная Selaginella lepidophylla «оживает» после почти полного высыхания и хранения в течение многих месяцев, если ее поместить в воду
Среди животных это, помимо коловраток и тихоходок, микроскопические представители круглых червей (Nematoda), личинки комаров-звонцов Polypedilum vanderplanki, цисты ракообразных Artemia salina (рис. 5).
5. Жаброногий рачок Artemia salina и его сухие цисты, сохраняющие жизнеспособность в течение нескольких лет после высыхания до 10% остаточной влажности
Другой тип ксероанабиоза, «онтогенетический», предопределен характером развития организма, который направлен на подготовку к выживанию в неблагоприятных условиях. Всем известные примеры из мира растений — семена и пыльца. У некоторых видов микроорганизмов (бактерий и микроскопических грибов) эволюционно закреплена способность переходить в состояние споры. На рис. 6 показаны бактериальные эндоспоры, то есть споры, образующиеся внутри клеток. Переход этот, сложный и многостадийный, происходит, когда в среде снижается концентрация некоторых компонентов питания. Для спор по сравнению с вегетативными клетками характерно более низкое содержание воды (30—50% против 75—80%). Метаболическая активность в них практически отсутствует, и на этом основании их также можно считать анабиотическим состоянием бактерий.
Низкотемпературный анабиоз, или криоанабиоз, известен благодаря лабораторным исследованиям, поскольку в природных условиях сверхнизкие температуры (ниже -80°С) не встречаются. Так, установлено, что практически все виды микроорганизмов могут переживать замораживание вплоть до температуры кипения жидкого азота (при нормальном атмосферном давлении это -196°С).
6. Эндоспоры сенной палочки Bacillus subtilis в световом микроскопе (слева) видны как бесцветные включения, невосприимчивые к красителю. При электронной микроскопии (справа) выявляется структура споры с многослойной оболочкой и электронно-плотной сердцевиной
В анабиозе организмы могут находиться подолгу: коловратки и тихоходки — до 120 лет, семена лотоса — 1500 лет, семена финиковой пальмы — около 2000 лет. Недавно группа российских ученых из Пущинского научного центра РАН под руководством Д.А.Гиличинского сообщила об успешном проращивании смолёвки узколистой Silene stenophylla из плацентарной ткани плодов этого цветкового растения, которые пролежали в вечной мерзлоте при температурах около -7°С примерно 30 тысяч лет. Факт экстраординарный, поскольку при этих температурах могут не наступить ни полное замораживание растительных тканей, ни криоанабиоз. Любопытно, что хранившиеся там же семена растения оказались нежизнеспособны. Результаты этой работы были представлены в журнале «Proceedings of the National Academy of Sciences USA», 2012, 109, 10, 4008—4013, doi:10.1073/pnas.1118386109.
А вот, пожалуй, самые удивительные случаи. В 1995 году «Science» опубликовал статью микробиологов из Калифорнийского политехнического университета («Science»,1995, 268, 5213, 1060—1064, doi: 10.1126/science.7538699) об оживлении спор бактерий Вacillus sphericus из кишечника пчелы, мумифицированной в янтаре 25—40 миллионов лет назад! Однако в 2000 году сотрудники Уэстчестерского университета в Пенсильвании («Nature», 2000, 407, 6806, 897—900, doi: 10.1038/35038060) побили этот рекорд, описав оживление спор неизвестной бациллы, пролежавшей в кристалле соли около 200 миллионов лет. Справедливости ради следует отметить, что скептически настроенная часть научного сообщества, несмотря на всю тщательность, с какой были описаны исследования, не верит в оживление микроорганизмов после столь длительного пребывания в метаболически неактивном состоянии. Основной аргумент скептиков — теоретический: из-за фоновой радиации в ДНК спор за столь длительное время должны были накопиться несовместимые с жизнью повреждения, которые в отсутствие метаболизма не могли быть отремонтированы.
Переход в анабиоз позволяет повысить устойчивость организмов к неблагоприятным воздействиям. Первым обнаружил это все тот же Спалланцани, любопытству которого, похоже, не было предела. В отличие от своих предшественников он не удовлетворился лишь наблюдением за оживлением высохших микроскопических животных, а исследовал влияние на них различных температур, разреженной атмосферы, электричества и некоторых химических веществ. Он установил, что высохшие коловратки сохраняли жизнеспособность при температурах до 73°С, тогда как в активном состоянии погибали уже при 45°С. К настоящему времени на многочисленных объектах показано, что в анабиозе существенно возрастает устойчивость к повышенной температуре, химическим агентам, ионизирующей и ультрафиолетовой радиации. И здесь также есть свои чемпионы. На первое место можно поставить эндоспоры бактерий: они не только существенно превосходят родительские вегетативные клетки по устойчивости к отдельным вредоносным факторам, но оставляют далеко позади практически все живые формы, в том числе находящиеся в состоянии анабиоза, по совокупности экстремальных факторов, которые могут перенести. Впечатляющую устойчивость к экстремальным воздействиям проявляют в состоянии ксероанабиоза тихоходки — значительно более сложные организмы, чем бактерии. В состоянии ксероанабиоза они сохраняют жизнеспособность после прогрева при 100°С, облучения ионизирующим излучением в дозах в 1000 раз больше летальных для человека и даже выдерживают кратковременное пребывание в открытом космосе.
В природе встречается большое разнообразие проявлений гипобиоза. В большинстве случаев гипобиоз — это ответ организма на похолодание до температур, существенно ниже оптимальных для жизнедеятельности. Такая реакция известна у некоторых теплокровных животных как спячка (гибернация), у насекомых (диапауза), земноводных, рептилий. К гипобиозу можно отнести осенне-зимний покой растений или их частей — корней, клубней.
Многие холоднокровные организмы могут пережить в состоянии гипобиоза даже температуры замерзания воды. Обычно это удается видам, которые сами могут оставаться не замороженными. Но есть уникальное исключение — лесная лягушка Rana sylvatica. Зимой 35—45% воды в ее теле превращается в лед, тело животного становится твердым как кусок льда (рис. 7). Секрет лягушки в том, что замерзает только вода, находящаяся у нее под кожей и между клетками мышц. В основных органах и тканях лед не образуется, иначе животное погибло бы. А так с приходом весны лесные лягушки благополучно «оттаивают» и приступают к брачным церемониям.
7. Лесная лягушка Rana sylvatica — чемпион мира по гипобиозу в замороженном состоянии (слева — в обычном состоянии, справа — твердая как кусок льда)
Конечно, не только животным и растениям, но и микроорганизмам приходится зимовать в низкотемпературном гипобиозе. Однако у них еще есть особые состояния, не связанные с низкими температурами, которые также можно отнести к гипобиотическим. Некоторые бактерии (например, Azotobacter vinelandii) и простейшие (Entamoeba histolytica) трансформируются в так называемые цисты при недостатке в среде питательных веществ или в присутствии агрессивных химических соединений. Цисты — это уменьшенные в размерах клетки с утолщенной клеточной стенкой и замедленным метаболизмом.
Еще одна разновидность гипобиоза в мире микробов была выявлена сравнительно недавно, благодаря более тщательному изучению одного хорошо известного феномена. При культивировании на плотной питательной среде каждая жизнеспособная клетка должна размножиться и дать видимую невооруженным глазом колонию. Если сопоставить число колоний с числом клеток, подсчитанных под микроскопом, то окажется, что не все клетки способны размножаться. Долгое время считалось, что клетки, не давшие колоний, попросту нежизнеспособны. Но оказалось, что они вполне живые, только впали в некое состояние, при котором отказываются делиться на среде, пригодной для обычных клеток. У них снижена метаболическая активность, изменена морфология, и для начала деления им необходимы другие условия, которые не всегда известны. Эти клетки, состояние которых также можно характеризовать как гипобиотическое, в специальной литературе называют «покоящимися» (англ. dormant или quiescent). Следует особенно отметить, что микроорганизмы в гипобиотическом состоянии обладают повышенной устойчивостью к химическим агентам, в том числе к антибиотикам.
Жизнь — это «одушевленная» вода
Во всех известных случаях переход в анабиоз так или иначе связан с водой: при ксероанабиозе в живых организмах снижается ее общее содержание, а при криоанабиозе у воды меняется агрегатное состояние, из жидкой она становится твердой. Чтобы понять, как это сказывается на структурно-функциональном состоянии клеток и их компонентов, остановимся вкратце на той роли, которую вода играет в существовании живой материи.
Из всех веществ, существующих в условиях земной атмосферы в виде жидкостей, только в воде биологические молекулы могут собраться вместе и превратиться в то, что мы называем жизнью. Эту уникальную роль вода исполняет в значительной мере благодаря водородным связям между атомами водорода и кислорода соседних молекул (рис. 8).
8. Водородная связь образуется между частично электроположительными атомами водорода и электроотрицательными атомами кислорода молекул воды
Молекула H2O способна образовать водородные связи с четырьмя соседними: по одной — каждый протон и две — кислород. Однако при положительных температурах из-за теплового движения в каждый момент времени одна молекула участвует в образовании примерно трех связей (формальный статистический анализ дает значение 3,4). Тем не менее этого достаточно, чтобы молекулы воды компактно упорядочились в кластеры, между которыми встраивается некоторая часть «неспокойных» подвижных молекул. При пониженных температурах движение молекул замедляется, и каждая образует все четыре водородные связи. Так формируются кристаллы льда с меньшей плотностью упаковки молекул, чем в жидкой фазе: именно это делает лед легче воды (рис. 9).
9. Сферические модели жидкого (а) и кристаллического (б) состояния молекул воды
Энергия водородной связи сравнительно невелика (таблица 1) и примерно в пять раз превышает энергию теплового движения молекул при температуре 25°С. Тем не менее этого достаточно, чтобы молекулы воды позволяли одному типу молекул растворяться в себе, а другому — нет. Все дело в том, что растворение — это встраивание чужих молекул между своими. Молекулам воды и самим тесно, ведь водородные связи их сближают, поэтому для растворения эти связи необходимо разрывать. Но этого недостаточно. Для обеспечения термодинамической устойчивости молекулам воды необходимо образовать с «чужаками» новые связи не слабее водородных, например ионные. В противном случае «чужаков» придется вытолкнуть и вновь сомкнуть ряды, восстановив разрушенные связи.
Таблица 1. Энергия химических связей
Растворимые в воде (гидрофильные) вещества — это ионы и дипольные молекулы, а нерастворимые (гидрофобные) — молекулы, не несущие зарядов, например углеводороды. Но есть и еще одна категория веществ — амфифильные, одна часть молекулы которых гидрофильна, а другая гидрофобна (рис. 10).
10. Амфифильная молекула фосфатидилхолина — одного из фосфолипидов биологических мембран
Амфифильные молекулы замечательны своей способностью к самоорганизации в водной среде в надмолекулярные структуры. Эти структуры стабилизированы ионными связями молекул воды с гидрофильными частями, гидрофобным взаимодействием неполярных частей, в которых при сближении происходит взаимоиндукция зарядов и образуются связи Ван-дер-Ваальса. Так формируется фосфолипидный каркас клеточных мембран, в который встроены белковые молекулы. Те же принципы лежат в основе организации третичной структуры белков (рис. 11) и нуклеиновых кислот.
11. Формирование третичной структуры белков. Вверху — основные типы связей, способствующих сворачиванию полипептидной цепи в глобулу. Внизу — сферическая модель третичной структуры фермента гексокиназы. Если бы этот белок, состоящий из двух полипептидных цепей по 920 аминокислот в каждой, не укладывался в глобулу, его длина составила бы около 0,6 мкм, что сопоставимо с диаметром бактерий Escherichia coli
Следует подчеркнуть два обстоятельства. Во-первых, свои функции в клетках могут выполнять только правильно структурированные макромолекулы и биомембраны. Во-вторых, структура их поддерживается сравнительно слабыми физическими связями, которые полностью зависят от наличия воды.
Однако вода не только придает структуру макромолекулам и биомембранам; вода — это еще и специфическая среда, в которой протекают биохимические реакции. Особенно важны здесь такие ее свойства, как способность к диссоциации на протон и гидроксил, диффузионные характеристики, формирование гидратных оболочек при взаимодействии с растворенными веществами и надмолекулярными комплексами и многие другие. Снижение содержания воды внутри и снаружи клеток существенно нарушает функционирование биосистемы, становится стрессом для нее. Почему же клетки одних организмов сохраняют жизнеспособность после высушивания или замораживания, а другие погибают?
Стратегии приспособления к водному стрессу
Реакции клеток на водные стрессы при положительных и отрицательных температурах различаются, но в основе некоторых из них лежат общие принципы. Так, на первых этапах высушивания при положительной температуре или при образовании льда снаружи клеток происходит концентрирование веществ в окружающей среде. Это приводит к так называемому осмотическому стрессу (точнее, гиперосмотическому, ведь бывает еще и гипоосмотический, при котором концентрация растворенных веществ вне клетки опускается ниже оптимума). В норме концентрация веществ в клетках больше, чем снаружи, а активность воды соответственно меньше. (Напомним, что активность воды в данном контексте — это ее эффективная мольная доля в образце.) Цитоплазматическая мембрана сравнительно хорошо проницаема для воды и непроницаема для большинства внутри- и внеклеточных веществ. Молекулы воды согласно законам диффузии всегда перемещаются в ту часть пространства, где их активность меньше, поэтому они стремятся в клетки. В результате создается избыточное давление на цитоплазматическую мембрану изнутри, которое называется осмотическим давлением, или тургором. Благодаря тургору мембрана расправлена, как оболочка надутого воздушного шарика, и такое состояние необходимо для ее функционирования. Дело в том, что цитоплазматическая мембрана — это не просто полупроницаемая пленка, а сложный ансамбль молекулярных структур, обеспечивающих избирательный транспорт веществ, восприятие и передачу внешних сигналов, координированный рост и деление клеток. У многих одноклеточных она также служит для обеспечения движения, а у бактерий участвует в трансформации энергии. Если активность воды снаружи клеток станет меньше, чем внутри, то внутриклеточная вода будет выходить наружу, тургор понизится, мембрана сморщится. Кроме того, в цитоплазме вырастут концентрации всех растворенных веществ, включая ионы К+ и Na+, которые в высоких концентрациях токсичны, так как разрушают внутри- и межмолекулярные ионные связи в белках и надмолекулярных комплексах (биомембранах, рибосомах и т. п.).
Итак, для клеток обезвоживание — стресс. Как ему можно противостоять?
Внутриклеточные механизмы приспособления к осмотическому стрессу наиболее подробно изучены у микроорганизмов. Будучи одноклеточными, они напрямую контактируют со средой, подчас неблагоприятной, и каждой клетке приходится надеяться только на себя. Многоклеточные организмы используют стратегию «коллективной безопасности»: большая часть их клеток изолирована от прямого контакта с внешней средой. Кроме того, микроорганизмы — удобный объект для исследований.
Чтобы заставить воду вернуться в клетки после осмотического стресса, необходимо уменьшить ее активность внутри клеток, например накапливая в них водорастворимые (осмотически активные) вещества — осмолиты. У микроорганизмов в ходе эволюции выработались две стратегии, направленные на решение этой проблемы. Первая основана на накоплении в клетках ионов К+, вторая — органических осмолитов.
Как уже отмечалось, для «обычных» клеток высокие внутриклеточные концентрации К+ токсичны. Поэтому первую стратегию используют лишь некоторые бактерии, и толь- ко для кратковременной компенсации резкого снижения тургора. Исключение составляет сравнительно небольшая группа — галофильные («любящие соль») археи и бактерии, обитающие в водоемах и почвах с высокой концентрацией солей (до 30% NaCl). У этих микроорганизмов особые белки и мембраны, которым для обеспечения правильных структур и функций даже необходимы сравнительно высокие внутри- клеточные концентрации ионов К+ и Na+. Поэтому в условиях осмотического стресса они могут использовать накопление К+ в качестве компенсаторного механизма.
Таблица 2. Основные совместимые вещества и микроорганизмы, в которых они обнаружены.
Большая часть микробного мира — бактерии, дрожжи и водоросли — в ответ на осмотический стресс накапливает из среды или синтезирует так называемые совместимые вещества (англ. compatible solutes), то есть вещества, накопление которых в клетках совместимо с сохранением биологических функций (таблица 2). Это пестрая в химическом отношении группа веществ, в нее входят аминокислоты, гликозиды, сахара, полиолы, фосфодиэфирные соединения. Некоторые из них выступают в качестве протекторов и при других видах стрессов, в частности при низкотемпературном замораживании и высушивании. Иными словами, именно они могут способствовать переходу клеток в крио- и ксероанабиоз.
Молекулы анабиоза
Низкотемпературное замораживание — в любом случае суровое испытание, но протекать он может по-разному. При небольших скоростях охлаждения лед прежде всего образуется во внеклеточной среде, активность воды там уменьшается, и вода успевает выйти из клеток, что приводит к их дегидратации. Повреждению мембран при этом способствует и повышение концентрации неорганических солей во внеклеточной среде. При быстром охлаждении внутриклеточная активность воды тоже снижается, но уже вследствие льдообразования внутри клеток. Добавим, что низкие температуры сами по себе отрицательно влияют на структуру и функции макромолекулярных и надмолекулярных компонентов клеток.
Самым благоприятным для живых организмов мог бы быть такой режим охлаждения, при котором вода переходит не в кристаллический лед, а в стекловидное состояние, и все молекулы «мгновенно» застывают. С чистой водой это произойдет при скоростях отвода тепла более 107 °C/сек, в присутствии некоторых криопротекторов скорости могут быть меньше. Для большинства биообъектов это условие не удастся выполнить из-за физических ограничений по теплопередаче, но для одноклеточных его можно реализовать, например, распыляя образец на металлические поверхности с температурой -196°С (экспериментально доступная температура кипения жидкого азота при нормальном атмосферном давлении).
Важна и скорость отогрева: в общем случае чем она выше, тем лучше. При медленном поступлении тепла возможна рекристаллизация — превращение мелких кристаллов льда в более крупные, что, как оказалось, усугубляет повреждения.
Таким образом, чтобы перейти в криоанабиоз, клеткам необходимы средства защиты — криопротекторы. У многих, если не у всех микроорганизмов в роли криопротекторов могут выступать совместимые вещества, в первую очередь сахара и полиолы. Не раз была продемонстрирована корреляция между внутриклеточным содержанием того или иного совместимого вещества и жизнеспособностью микробных клеток, подвергавшихся замораживанию — оттаиванию в разных режимах. Более того, глицерин, сахароза и сравнительно высокие концентрации (0,3 M) трегалозы способны защищать микробные клетки от низкотемпературных повреждений, даже когда их просто добавляют во внешнюю среду.
Попутно заметим, что глицерин в сравнительно высоких концентрациях встречается в крови полярных рыб: вместе с некоторыми белками он выступает в роли антифриза, снижающего температуру замерзания крови. Ту же роль играют глицерин и трегалоза в гемолимфе некоторых морозостойких насекомых.
Механизм защитного действия криопротекторов, многие детали которого еще предстоит выяснить, скорее всего, складывается из двух компонентов. Первый связан с их способностью смягчать осмотический стресс за счет стабилизации тургора. Представление о втором компоненте защиты было сформировано в исследованиях на изолированных белках и получило название «гипотезы вытеснения». Предполагается, что криопротекторы в высоких концентрациях по мере обезвоживания клетки вытесняют из водного окружения белков все растворенные вещества, в первую очередь неорганические ионы. Так удается сохранить гидратную оболочку молекул, образованную оставшимися молекулами воды, что и способствует поддержанию третичной структуры.
Переход в ксероанабиоз также сопряжен с водным стрессом, который на первых этапах обезвоживания представлен стрессом осмотическим. Поэтому неудивительно, что у организмов, способных к переходу в ксероанабиоз, было обнаружено повышенное содержание совместимых веществ. Удивительно другое — явное «превосходство» трегалозы в качестве ксеропротектора. Во-первых, во всех организмах, способных к ксероанабиозу, выявлено очень высокое содержание этого дисахарида (до 20% сухого веса). Во-вторых, прослежена корреляция между устойчивостью клеток, в частности микроорганизмов, к высушиванию при положительных температурах и содержанием в них трегалозы. В-третьих, установлено, что при высушивании трегалоза значительно лучше других осмолитов предохраняет от разрушения белки, а также изолированные биомембраны и искусственные фосфолипидные мембраны.
Напомним, что при ксероанабиозе активность воды в клетках снижается значительно больше, чем при криоанабиозе, — ее не хватит даже на то, чтобы покрыть все молекулы. Поэтому гипотеза вытеснения в данном случае неприменима. Известно, что трегалоза образует водородные связи с фосфатными остатками фосфолипидов биологических и искусственных мембран, а также с белками, и эти связи сохраняются после высушивания. Отсюда возникла «гипотеза замещения», согласно которой ксеропротекторы обеспечивают целостность биомембран и белков в высушенном состоянии за счет замещения воды. Однако эта гипотеза не объясняет, почему трегалоза эффективнее других сахаров, которые также способны образовывать водородные связи с белками и мембранами.
Вторая гипотеза получила название «гипотезы стекловидного состояния». Растворы сахаров при высушивании могут превращаться в аморфное стекло. Возможно, движения биомолекул, в первую очередь белков, заключенных в такую стеклянную оболочку, будут ограниченны, что приведет к замедлению или прекращению реакций их деградации. Тогда преимущество трегалозы перед другими сахарами объясняется ее относительно высокой температурой стеклования и химической инертностью. Последнее обстоятельство может быть критическим, поскольку другие сахара способны вступать с белками в химическую реакцию Майяра, что приводит к деградации белка.
В итоге
В мире живого известно много видов адаптационных реакций, но, наделяя некоторые организмы способностью переходить в состояние анабиоза, природа, кажется, перешагнула пределы своих возможностей. Живое существо временно становится неживым; жизнь обратимо прекращается на молекулярном уровне. Впору вновь вернуться к мировоззренческому вопросу «что такое жизнь?», если граница между живым и неживым так неопределенна. Явление анабиоза представляет особый интерес для сторонников гипотезы панспермии. В качестве одного из аргументов они используют данные о радиационной устойчивости бактериальных спор, ведь в открытом космосе высок уровень губительной для всего живого ионизирующей радиации.
Анабиоз и гипобиоз представляют интерес и с практической точки зрения. Устойчивость к противомикробным агентам спор таких опасных болезнетворных микроорганизмов, как клостридии ботулизма Clostridium botulinum и бациллы сибирской язвы Bacillus anthracis, — серьезная проблема для медиков. Другая, уже упоминавшаяся проблема — покоящиеся (гипобиотические) состояния патогенных микроорганизмов, «невидимые» для лабораторных тестов, основанных на регистрации размножения клеток.
Фантасты любят отправлять своих героев в длительные космические одиссеи в состоянии анабиоза (хотя, судя по описаниям, имеют в виду низкотемпературный гипобиоз). Однако и на Земле есть много важных задач, для решения которых требуется перевод живых организмов в анабиоз. До людей очередь пока не дошла, но длительное хранение некоторых биологических материалов в крио- и ксероанабиозе — уже реальность. В коллекциях культур хранятся жизнеспособные микроорганизмы разных таксономических групп, клеточные линии животных и растений. В криобанках — семена растений, сперматозоиды, яйцеклетки, эмбрионы и стволовые клетки. Все эти биообъекты замораживают в определенных режимах с использованием криопротекторных сред. Клетки бактерий, дрожжей, споры некоторых мицелиальных грибов можно законсервировать в состоянии ксероанабиоза с помощью технологии высушивания из замороженного состояния (лиофилизации). С другими клетками такое пока не удается. Единственное исключение — тромбоциты, которые после лиофилизации сохраняют способность активироваться и участвовать в свертывании крови.
На этом завершается наш рассказ об анабиозе и гипобиозе, но не заканчиваются исследования этих удивительных явлений. Более глубокое понимание их сущности, очевидно, позволит создавать и другие полезные технологии, в том числе такие, которые сейчас представляются невозможными. А может быть, и внесет новый вклад в философию биологии, в очередной раз дополнив определение жизни.
Пучков Е.О.
Источник: «ХиЖ», 2015, №1
Свежие комментарии